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Scriptus Naturae (http://scriptusnaturae.8m.com). Pérez, S.; Suárez, M. Torralba, A. & Varela de Seijas M.V.1998.-Aplicación de métodos moleculares en taxonomía y filogenia. Seminario Microbiología Ambiental, 23.04. Facultad Biología Oviedo.

Mapas de biodiversidad basados en la secuenciación.

Antes del desarrollo de los métodos de secuenciación de bases, era imposible conocer las relaciones evolutivas que conectaban todas las formas de vida, así como dibujar un árbol evolutivo general

Hace más o menos dos décadas los organismos celulares se dividían en 5 reinos: Animalia, Planta, Fungi, Protista y Monera (bacteria). Adicionalmente los constituyentes de estos cinco reinos eran caracterizados en dos grupos eucariotas o procariotas de acuerdo a si poseían una membrana rodeando a su material genético (membrana nuclear). Se creyó que la máxima diversidad estaba en los eucariotas y se le concedió a los procariotas el galardón de uniformes en cuanto a sus propiedades.

El paso principal llegó con Carl Woese, quién comparando secuencias de RNAr estableció un árbol filogenético que puede ser usado para relacionar todos los organismos, así como para reconstruir la historia de la vida. Así se reconocieron las tres líneas primarias de evolución, denominadas dominios: Eucarya (eucariotas), Bacteria (inicialmente eubacterias) y Archeae (inicialmente arqueobacterias).

Los estudios de la subunidad pequeña del rRNA ha hecho que haya una revisión de todos estos conceptos y nociones. Estos estudios filogenéticos basados en el rRNA nos dan una información que hace organizar a los distintos organismos de otro modo como podemos ver en el árbol de la vida.:

Este árbol se ha realizado teniendo en cuenta las distancias evolutivas entre los distintos organismos. Como se ve, cuando los datos son estructurados en árboles se observan tres dominios o grupos primarios: Archaea (archeabacteria), Bacteria (eubacteria) y Eucarya (eucariota). Y podemos observar cosas curiosas insospechadas hasta ese momento como que aunque Archeae y Bacteria son ambas procariotas, no por ello están más emparentadas, pues de hecho lo están mucho más Archaea y Eucarya a pesar de diferencias a priori insalvables.

Así mismo encontramos otras nuevas perspectivas y líneas en el estudio de la evolución, pues parece que la vieja idea de que las células eucariotas fuesen el resultado de la unión de dos células procariotas hace 1500 millones de años es errónea. Pero lo que sí parece correcto que es que el origen de cloroplastos y mitocondrias es bacteriano, pues tenemos constancia de que genomas parecidos a los que contienen estos dos orgánulos eucariotas se encuentran en varios grupos del dominio bacteria.

De acuerdo con estos estudios comentados del rRNA, se abren nuevas perspectivas en cuanto a diversidad se refiere pues se tienen nuevos conceptos y modos de clasificación de los organismos existentes y así pues además de los tres dominios citados existirían unos doce reinos más en Eucarya y otros tantos más en Bacteria, esto da una nueva perspectiva de la diversidad en el planeta. Así sólo una mínima parte de los microorganismos han sido descritos y muchos menos han sido analizados... y es que nuestra percepción de la diversidad es bastante limitada.

La figura de la derecha muestra un árbol filogenético basado en las secuencias de RNAr de las subunidades pequeñas del ribosoma. La construcción de este árbol es conceptualmente simple. Pares de secuencias de RNAr de organismos distintos se comparan, las diferencias se valoran y se toma como medida de la distancia evolutiva entre esos organismos (sólo los cambios en las bases nucleotídicas). Por otro lado, los árboles filogenéticos basados en genes metabólicos, que envuelve la manipulación de pequeñas moléculas y su interacción con el medio, no suelen coincidir con las versiones basadas en el RNAr. Las incongruencias en los árboles filogenéticos elaborados con distintas moléculas reflejan transferencias o mezclas genómicas en el curso de la evolución. Por ejemplo, algunos genes de Archeae parecen más relacionados con bacterias que con sus homólogos los eucariotas; otros se asemejan más a genes eucariotas; y otros son únicos de estas. La reciente determinación de la secuencia de Methanococcus jannaschii (Archeae) muestra que el linaje de las Archeae es independiente de Eucarya y Bacteria.

La construcción de árboles moleculares a partir de métodos taxonómicos basados en secuencias, solamente una secuencia de genes, y no una célula funcional, es requerida para identificar el organismo en términos de su tipo filogenético y además, el análisis por este método de ecosistemas microbianos es más que un ejercicio taxonómico, ya que las secuencias proporcionan herramientas experimentales (por ejemplo, sondas de hibridación molecular) que pueden ser usadas para identificar, observar y estudiar los habitantes microbianos de los ecosistemas naturales.

Diversidad natural sin cultivo de los microorganismos.

Para caracterizar a los organismos debemos secuenciar uno o más genes (o los ya dichos referentes a la subunidad 16S de la subunidad pequeña del ribosoma) y esto lo podemos hacer en el mismo ambiente en que vive el organismo, es decir aislamos el DNA y luego obtenemos los genes del rRNA. Pero esto es mucho más que un ejercicio taxonómico pues estas secuencias obtenidas nos pueden servir para muchas cosas:

Actualmente se usan dos estrategias a la hora de aislar rRNA genes del total de los ácidos nucleicos. Una aproximación es clonar fragmentos al azar de DNA del medioambiente y analizar aquellos que contienen rRNA genes. Este método se ha usado para el estudio de picoplancton marino (organismo de menos de 2 m de diámetro).

Como la cantidad de DNA clonado que contiene genes de rRNA es pequeña, el segundo paso, casi obligado, es la utilización de la PCR para amplificar este rRNA. Como el rRNA esta altamente conservado en la naturaleza los investigadores utilizan primers universales para los tres dominios de organismos(eucariotas, bacterias y arqueobacterias), desde todos los puntos parece aconsejable el uso de la PCR pues se necesita amplificar el rRNA que antes sólo formaba una pequeña parte del total.

La manera más rápida de obtener los constituyentes de los ecosistemas microbianos es pues mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En principio la PCR realizada con estos primers amplifica los genes de RNA de todos los tipos de organismos presentes en un ambiente. Los tipos individuales de genes en la mezcla son separados en principio por clonación y posteriormente son secuenciados.

Una valoración filogenética con base molecular de un organismo no cultivado puede proporcionar información acerca de propiedades de dicho organismo mediante comparación con otros. Un ejemplo podemos verlo en los microorganismos oxidantes de sulfuro que proporcionan nutrientes a invertebrados simbióticos como el gusano tubícola bentónico Riftia pachyptila. A pesar de que muchos intentos de cultivar estos simbiontes para caracterizarlos fenotípicamente fallaron, los análisis con rRNA revelan que son familiares cercanos a los microorganismos E. coli y Pseudomonas aeruginosa. Debido a su proximidad filogenética, muchas de las propiedades de los simbiontes pueden ser deducidas a partir de los correspondientes en los organismos bien estudiados.

Otro ejemplo lo encontramos en el caso de Chromatium vinosum que es un sulfridrico-oxidante y Escherichia coli que vive a expensa de oxidar compuestos orgánicos; estos dos organismos tras estudiarlos por los métodos citados vemos que se han de englobar juntos dentro del "grupo" de proteobacteria.

Y es que los mecanismos celulares de obtención de energía han evolucionado muy volátilmente, es decir han divergido mucho más que otras funciones celulares que se han mantenido mucho más permanentes a través de la evolución. Por ejemplo, la filogenia nos ofrece una perspectiva de gran disparidad en los microorganismos sulfoxidantes.

Asimismo podemos encontrar otros casos en que la filogenia nos ha servido para identificar a una bacteria que a priori parecía inclasificable como es el caso de Epulopiscium fishelsonii, la mayor bacteria conocida. Se encuentra en los intestinos de peces de arrecifes; al principio se pensaba que se trataba de un protozoo eucariótico por su gran tamaño (de más de 600 m de longitud, un millón de veces más grande que una bacteria típica). Además su modo de reproducción es bastante raro, pues de divide por fisión binaria en la cual crea dos células hijas intracelulares que más tarde expulsa.

Los estudios de rRNA de este extraño organismo dieron como resultado una aproximación al grupo Clostridium, del grupo de las Metabacterias. Especialmente se parecía a algunas especies de este género que vivían anaerobiamente en el aparato digestivo de algunos rumiantes, y que esporulan. Tras diversos análisis se comprobó que el proceso de formación de células hijas intracelulares se asemejaba a los primeros pasos de la esporulación en Clostridium.

Introducción

Interpretación del árbol molecular de la vida.

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